密码子优化是基因表达优化的关键步骤之一。其中涉及mRNA二级结构、稀有密码子、核糖体结合位点等关键因素。简单说，基因能否顺利表达蛋白与稀有密码子含量、mRNA结构是否阻碍翻译有很大关系。基因表达优化还包括载体，表达系统特异性，表达条件优化。
密码子优化涉及的优化点可以从基因合成、载体构建、基因转录、mRNA翻译、翻译后修饰等过程中提取，目的只有一个，就是便于相关过程的高效达成。以下是部分优化内容：
1.1基因合成：平衡GC含量、正反向重复序列、二级结构。
1.3基因转录：平衡GC含量、平衡CpG岛、SD序列、Kozak序列、TATA框 Chi位点、终止信号、隐蔽剪切位点。
1.4mRNA翻译及折叠：密码子偏好性、GC含量polyA位点信号、mRNA二级结构、mRNA自由能、核糖体绑定位点。
许多motif在基因表达过程中承担着重要的角色，随着研究的不断开展，功能性motif也在不断被发现。举例如下：
2.1 TATA框：是构成真核生物的启动子元件之一，位于转录起始点上游-30bp处，它可以保证转录的正确定位。
2.2 SD序列: 作为原核表达的核糖体绑定位点，是翻译必不可少的信号。
2.3 Kozak 序列：真核生物中符合 Kozak 规则的基因，其转录及翻译效率较好。
2.4 Chi 序列：在原核生物中能够增加自然重组的几率，可能会影响人工重组蛋白的表达。
25 隐蔽剪切位点：真核生物中存在大量的隐蔽剪切位点(cryptic splice sites)，一旦被激活，会造成 mRNA 的剪接偏离我们的预期。
重复序列过多，会增加基因合成的难度。反向互补序列也对 mRNA 二级结构有重要影响。科沿有道可以对序列进行分析，找出序列中重复序列的位置并计算得到重复序列的退火温度。
相对于AT配对需要2个氢键，GC配对是3个氢键，GC含量直接影响着PCR退火温度。在启动子等保守区域GC含量相对较高。GC含量也影响着mRNA热力学稳定性及mRNA二级结构。
mRNA二级结构是影响翻译过程的重要因素，复杂稳定的二级结构会阻碍翻译过程的顺利进行，特别是核糖体绑定位点（RBS）附近的二级结构。mRNA的二级结构预测是一个复杂的过程，需要考虑碱基配对、自由能等多种因素，进行密码子优化可以快速有效识别发卡（Hairpin）结构区并进行有效规避。
不同物种的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的。在外源基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，外源基因的表达水平会显著提高。常用密码子适应指数（Codon Adaption Index）来表示。
根据序列和相应宿主细胞及遗传密码子表，可得到该序列在宿主细胞的密码子适应指数CAI。
限制性酶切位点需要根据实际情况进行排除，以免与需要用到的酶切位点产生冲突，影响重组基因的操作。
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