实验目的:建立大鼠糖尿病溃疡模型,以血竭素全身或局部干预处理,分析血竭素对大鼠糖尿病溃疡组织微环境改变情况,并比较全身干预与局部干预的差异性。
实验方法:分子实验检测(修复相关的以及炎性信号通路,包括组织修复过程的通路),蛋白检测(ELISA,WB),免疫组化(胶原)等。
采用低剂量链脲佐菌素(STZ)注射建立糖尿病大鼠模型。在脊柱两侧制作面积为10平方厘米的皮肤创面,形成糖尿病溃疡模型。分为四组,每组10-30只(需要多少只需要由实验员根据经验进行确定)。
1. 模型组:只建立糖尿病溃疡模型,干预处理为0.9%的生理盐水;
2. 血竭素全身治疗组:糖尿病溃疡处理+干预处理,干预处理为给予血竭素高氯酸盐20mg/kg/d灌胃;
3. 血竭素创面治疗组:糖尿病溃疡处理+干预处理,干预处理为涂抹血竭素高氯酸盐于创伤面。
4. 血竭素全身+创面治疗组:干预处理为同时给予血竭素高氯酸盐20mg/kg/d灌胃及涂抹血竭素高氯酸盐于创伤面。
取样方法:治疗周期14d,刮取创面肉芽组织,匀浆并进行相关分析。
1) 1.1 Elisa法分析血浆、组织匀浆液中抑制细胞成活的因素:炎症因子(IL- 6)、氧化应激(MDA、SOD);
1.2 血浆、组织匀浆液中促进细胞成活的因素:FGF、TGF,每组检测6只大鼠。
2)免疫组化检测创面肉芽组织CD34(目的是表明新生毛细血管数在血竭素处理组增多,利于组织的修复),TGF-β1(血小板源生长因子PDGF及转化生长因子TGF-β1在损伤早期阶段(1-8小时)有阳性表达,随伤后存活时间的延长,其免疫活性逐渐升高,具有一定的规律性),也有报道说糖尿病创面难以愈合可能与TGFβ1表达水平下降有密切关系。每组检测3只大鼠。
3)HE染色:看血竭素处理组的病理损伤是否减少。成纤维细胞数是否增加。
4)qPCR检测肉芽组织中FGF mRNA(成纤维细胞生长因子) 、TGF-β1、Smad3、Smad4的表达情况;每组检测3只大鼠。
5)Western Blot分析肉芽组织中TGF-β1、Smad3、磷酸化smad3(P-smad3)、Smad4、FGF蛋白的表达变化;每组检测3只大鼠。
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