动物实验中病理染色分析是研究疾病机制、药物疗效等诸多方面的关键技术，以下是常见的病理染色分析方法：
一、苏木精 - 伊红染色（H&E 染色）
- 原理
- 苏木精是碱性染料，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色。伊红是酸性染料，能使细胞质和细胞外基质中的成分着粉红色。
- 操作步骤
- 组织固定：通常使用 10% 福尔马林固定组织，使组织中的蛋白质凝固，防止细胞自溶等变化。
- 脱水：依次用不同浓度的乙醇（如 70%、80%、90%、95%、100%）处理组织，去除组织中的水分。
- 透明：用二甲苯等有机溶剂处理，使组织透明，便于石蜡渗透。
- 浸蜡：将组织放入熔化的石蜡中，使石蜡充分浸入组织。
- 包埋：将浸蜡后的组织放入包埋框，凝固成蜡块。
- 切片：用切片机将蜡块切成薄片（通常 4 - 6μm），然后将切片贴附在载玻片上。
- 染色：先将切片用苏木精染色，水洗后用伊红染色，再经过脱水、透明等步骤，最后用中性树胶封片。
- 应用场景
- 这是病理学中最基本的染色方法。用于观察组织和细胞的形态结构，如观察炎症细胞的浸润、肿瘤细胞的形态和分布等。例如，在研究肿瘤动物模型时，可以通过 H&E 染色观察肿瘤组织的细胞形态、核质比、是否有坏死区域等特征，以初步判断肿瘤的类型和分化程度。
二、Masson 染色
- 原理
- 利用不同组织对酸性染料和碱性染料的亲和力不同来显示组织成分。该染色主要用于区分胶原纤维和肌纤维。胶原纤维呈蓝色，肌纤维、红细胞呈红色，细胞核呈蓝黑色。
- 操作步骤
- 组织处理步骤与 H&E 染色前期类似，包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。
- 染色时，先将切片用 Weigert 铁苏木精染色液染色，然后用酸性品红 - 丽春红染色液染色，再用磷钼酸溶液处理，最后用苯胺蓝染色液染色，经过脱水、透明等步骤后封片。
- 应用场景
- 在动物实验中，常用于研究组织纤维化。比如在肝纤维化动物模型中，通过 Masson 染色可以清晰地观察到肝脏中胶原纤维的增生情况，评估纤维化的程度，为研究抗纤维化药物的疗效提供直观的依据。
三、免疫组织化学染色（IHC）
- 原理
- 基于抗原 - 抗体特异性结合的原理。先将组织中的抗原与特异性抗体结合，然后通过酶标或荧光标记的二抗来显示抗原的位置和表达情况。
- 操作步骤
- 组织处理：同样需要固定、脱水等常规步骤，不过为了保护抗原活性，固定液的选择和固定时间可能需要优化。
- 抗原修复：根据不同的抗原和组织类型，采用热修复（如高压锅法）或酶修复（如胰蛋白酶、胃蛋白酶修复）等方法，使抗原表位暴露。
- 封闭内源性过氧化物酶和非特异性蛋白结合位点，通常用 3% 过氧化氢和正常血清。
- 一抗孵育：加入针对目标抗原的特异性抗体，在合适的温度和时间下孵育（如 4℃过夜）。
- 二抗孵育：加入标记有酶（如辣根过氧化物酶）或荧光素（如 FITC）的二抗，孵育一定时间。
- 显色或荧光观察：若是酶标二抗，通过加入底物显色液（如 DAB）产生棕色沉淀来显示抗原位置；若是荧光标记二抗，则在荧光显微镜下观察荧光信号。
- 应用场景
- 在肿瘤研究中，可用于检测肿瘤标志物的表达。例如，在乳腺癌动物模型中，通过免疫组织化学染色检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 - 2（HER - 2）的表达情况，用于肿瘤的分型和治疗方案的选择。也可用于研究细胞增殖（如 Ki - 67 染色）、细胞凋亡（如 Caspase - 3 染色）等多种细胞生物学过程。
四、特殊染色（如普鲁士蓝染色）
- 原理
- 普鲁士蓝染色主要用于显示组织中的铁离子。三价铁离子与亚铁氰化钾反应生成普鲁士蓝沉淀，呈蓝色。
- 操作步骤
- 组织切片经固定后，放入普鲁士蓝染液（含亚铁氰化钾和盐酸）中染色，然后用核固红等进行复染，使细胞核着色，最后水洗、脱水、透明和封片。
- 应用场景
- 在研究铁代谢相关疾病的动物模型中很有用。例如，在血色病动物模型中，通过普鲁士蓝染色可以观察到肝脏、脾脏等组织中铁的沉积情况，帮助研究铁过载对组织器官的损伤机制。
五、病理染色方法的优缺点
以下是动物实验中常见病理染色分析的优缺点对比表格：
| 染色方法 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 苏木精 - 伊红染色（H&E 染色） | 操作简单、成本较低，是病理学中最基本的染色方法；能清晰地显示组织和细胞的形态结构，如细胞核、细胞质、细胞膜等的形态和分布，可用于观察炎症细胞浸润、肿瘤细胞形态等，对组织的病理学评估有重要意义 | 无法显示特定蛋白质或分子的表达及定位信息，不能深入了解细胞和组织的功能状态；对于一些细微结构或特殊成分的显示不够清晰，如胶原纤维等不如 Masson 染色明显 |
| Masson 染色 | 能够特异性地显示胶原纤维，使其呈蓝色，与肌纤维等其他组织成分区分明显，对于研究组织纤维化、瘢痕形成等病理过程有重要价值；可以提供更精细的组织结构信息，有助于鉴别一些在 H&E 染色中难以区分的病变 | 染色结果受染色剂选择、操作技术等因素影响较大，如染色时间、染液浓度等控制不当可能导致染色效果不佳；对组织固定的要求较高，固定不充分或固定液不合适可能影响染色结果 |
| 免疫组织化学染色（IHC） | 特异性强、灵敏度高，基于抗原 - 抗体特异性结合原理，能够准确地显示组织或细胞内特定蛋白质的表达和定位，可用于检测肿瘤标志物、细胞增殖和凋亡相关蛋白等；定位准确，可在细胞和组织水平上对蛋白质进行精确定位，有助于研究蛋白质在不同细胞类型和组织区域的表达差异，以及与形态学变化的关系 | 不能完整地观察病变的全貌，主要侧重于显示特定蛋白质的表达，对病灶的范围和整体病理变化显示不够清晰；不能进行全面的定量分析，只能进行半定量或相对定量分析，结果的准确性有限；容易出现假阳性和假阴性结果，受抗体选择、实验操作、组织处理等多种因素影响 |
| 普鲁士蓝染色 | 特异性地显示组织中的铁离子，对于研究铁代谢相关疾病，如血色病等，以及观察组织中铁的沉积情况具有重要意义；操作相对简单，染色结果易于观察，蓝色沉淀能够清晰地指示铁离子的存在部位 | 应用范围相对较窄，主要用于铁离子的检测，对于其他组织成分和病理变化的显示有限；不能提供关于组织细胞形态结构等方面的详细信息 |
六、案例
一、病理学分析：
描述各切片中典型的病变，包括：增生、肥大、萎缩、水肿、钙化、坏死、充血、瘀血、出血、炎症等，对病变部位做出标识并进行文字描述，并提供相应的word文档。
肝100~200倍（HE）
肝100~200倍（Masson）
肝脏组织可见肝小叶排列规则，肝细胞圆润、饱满，呈放射状排列，肝窦无明显扩张或挤压，相邻肝小叶之间的汇管区无明显异常，未见明显的坏死及炎性细胞浸润；Masson染色下肝细胞被染成红色，未见明显的胶原纤维增生。
肝100~200倍（HE）
肝100~200倍（Masson）
肝脏组织可见肝小叶排列规则，肝细胞圆润、饱满，呈放射状排列，偶见静脉周围少量淋巴细胞浸润（蓝色箭头）；Masson 染色下可见汇管区周围少量胶原纤维增生，染色呈深蓝色，轻度纤维化（红色箭头）。
三、评分类分析（结肠炎）：
对切片的病变程度做出评分，评分标准由客户提供，提供word报告。
病理描述+评分：在病理描述的基础上对切片病变程度进行评分。
阳性率分析：计算阳性细胞数及细胞总数，分析阳性细胞占比；
光密度分析：测量切片IOD值和组织面积，并计算个切片的平均光密度值，来反映各指标目的蛋白的表达强度；提供数据及表格；
测量内分析：可以计算各类结构的长，宽及面积等。
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