流式细胞分选对细胞有什么损伤？

流式细胞分选（FACS）可能对细胞造成以下几种损伤：

1. 细胞形态学变化和功能状态影响：流式细胞分选后，细胞可能会经历形态学变化，功能状态也可能受到影响。例如，分选后的神经细胞如果处于低鞘液压力、低分选速度的“温和”分选条件下，其功能状态会优于标准分选模式的结果。
2. 细胞生长延迟和活力降低：分选后的细胞可能会出现生长延迟和活力降低的现象。这是因为传统的空气喷射法分选方式很容易引发细胞分选后的细胞应激。
3. 基因表达的改变：流式细胞分选可能会引起基因表达的改变，这种改变可能是由于分选过程中的物理压力或应激反应引起的。
4. 细胞膜受损和细胞破碎：特别是在使用小尺寸喷嘴时，由于液滴较小，细胞在加电偏转时更有可能打在管壁上，造成细胞破碎。
5. 氧化应激和代谢变化：分选后的细胞可能会出现氧化应激反应，如较高的氧化与还原谷胱甘肽（GSSG/GSH）比率，以及活性氧（ROS）的积累。
6. 蛋白质组和磷酸化蛋白质组的变化：流式分选还可能引起蛋白质组和磷酸化蛋白质组的变化，这些变化可能影响细胞的信号传导。
7. 细胞应激反应（SICS）：分选过程可能引起细胞应激反应，导致细胞功能发生变化，甚至引起细胞死亡。这通常与选用错误直径大小的喷嘴有关，可能会在分选过程中直接对细胞群体造成损伤。

为了减少这些损伤，可以采取一些优化策略，比如使用更大直径的喷嘴以减少细胞受到的剪切力，摸索分选过程中的环境温度，更换分选收集buffer以提高buffer中血清比例，或者使用基于微流控芯片技术的无损伤流式细胞分选仪，这种技术可以更好地保护细胞，减少分选过程中的细胞损伤。

流式细胞分选（FACS）对细胞形态的影响主要体现在以下几个方面：

1. 细胞形态学变化：传统的流式细胞分选技术，尤其是基于空气喷射法的分选，可能会引起细胞形态学的变化。这种变化可能包括细胞膜的损伤，导致细胞破碎或形态改变。例如，使用On-chip Sort无损伤流式细胞分选仪与传统细胞分选仪对比时，On-chip Sort分选后的嗜酸性粒细胞基本保持完好无损，而传统方法分选后的细胞出现了破碎的情况。
2. 细胞生长延迟：流式细胞分选可能会影响细胞的生长速度。一些研究表明，使用传统流式细胞分选仪分选的细胞在分选后可能表现出生长延迟，与使用无损伤流式细胞分选仪分选的细胞相比，后者在分选后第二天就开始生长，并且在第三天细胞数量翻倍增长，显示出更快的生长速度。
3. 细胞活力降低：分选过程可能会对细胞活力产生负面影响。一些研究指出，流式细胞分选后，细胞可能会经历活力降低，这可能与分选过程中的高压、剪切应力等因素有关。
4. 基因表达的改变：流式细胞分选还可能引起基因表达的改变，这种改变可能是由于分选过程中的物理压力或应激反应引起的。这种基因表达的改变可能会进一步影响细胞的形态和功能。

综上所述，流式细胞分选对细胞形态的影响是多方面的，包括细胞形态的改变、生长延迟、活力降低以及基因表达的改变。这些影响可能会对后续的细胞功能和实验结果产生重要影响，因此在进行流式细胞分选时需要考虑这些潜在的影响，并尽可能采取措施来减少这些影响，例如使用无损伤流式细胞分选技术。

流式细胞分选（FACS）对基因表达的影响主要体现在以下几个方面：

1. 基因表达的动态监测：FACS技术可以用于监测细胞内基因表达的动态变化。例如，在定向进化中，通过FACS技术筛选具有特定底物识别能力的蛋白酶，可以用于筛选新酶基因，并通过特定底物分子诱导荧光蛋白的表达，从而监测基因表达。
2. 基因表达的高通量筛选：FACS技术可以实现对大量细胞的高通量筛选，这对于从宏基因组中筛选新酶基因尤为重要。通过将宏基因组片段插入到GFP基因上游，并用特定底物分子进行诱导，可以导致荧光蛋白的表达，从而通过FACS实验有效地获得新酶及其他功能性蛋白基因。
3. 基因表达与酶活性的关联：FACS技术可以将酶活性与荧光蛋白的表达量偶联，用于定向进化。例如，通过底物N-酰基高丝氨酸内酯诱导LuxR启动子表达的原理，成功地对N-酰基高丝氨酸内酯酶进行了定向进化。
4. 基因表达的调控：FACS技术可以用于研究基因表达的调控机制。通过FACS技术，可以筛选出具有特定基因表达模式的细胞群体，进而研究这些基因的调控网络。
5. 基因表达的异质性分析：FACS技术可以用于分析细胞群体中基因表达的异质性。通过单细胞水平的分析，可以揭示细胞群体中不同细胞亚群的基因表达差异。
6. 基因表达的扰动研究：FACS技术可以用于研究基因表达扰动对细胞功能的影响。通过筛选特定基因表达改变的细胞，可以研究这些基因在细胞功能中的作用。

综上所述，FACS技术在基因表达的研究中具有广泛的应用，不仅可以用于基因表达的监测和筛选，还可以用于研究基因表达的调控机制和异质性，以及基因表达扰动对细胞功能的影响。

流式细胞分选（FACS）技术在基因表达研究中的应用非常广泛，以下是一些具体的应用案例：

1. 酶定向进化中的应用：
   • FACS技术被用于酶定向进化中，通过构建酶突变文库并在人工选择压力下进行筛选。例如，Yang等人利用FACS对中性糖转移酶β-1,3-半乳糖基转移酶（CgtB）的突变文库进行了筛选，使用两种荧光基团标记底物，通过检测细胞的绿色荧光和蓝色荧光来判断CgtB的催化活性高低，从而进行后续的检测和筛选，最终获得了比天然CgtB活性提高了300倍的突变体。
2. 单细胞转录组与流式细胞术联合应用：
   • FACS技术能够针对特定细胞亚群进行精确分离，并对那些在细胞群体中数量占比低的细胞类型进行有效富集。通过荧光标记的特异性抗体进行识别和分选，再采用单细胞转录组测序技术对这些分离的细胞进行基因表达水平的定量分析，这一连贯的实验流程可以显著提升获取目标细胞亚群转录组数据的精确度，确保了研究结果的可靠性并实现对生物学意义的深度挖掘。
3. 高通量筛选新医学靶基因：
   • 通过结合磁力细胞分选（MACS）和流式细胞仪分选（FACS），研究者成功建立了一整套快速、敏感、适合工业化操作的筛选基因受体的新方法。该方法从mRNA的分离到筛选出表达受体的细胞，整个筛选周期仅为3周，成功筛选到了2个基因的受体。
4. 精子流式分离和低剂量授精研究：
   • 流式细胞高速分选术是被生产的后代证实有效的性别控制技术，可以获得高纯度的X、Y精子。该方法基于X和Y精子染色体DNA含量差别，采用活细胞荧光染料与精子DNA结合，分选获得活精子，随后用于子宫内人工授精或性控胚胎移植。本研究旨在将精子专用高速的流式细胞分选技术用于梅花鹿、马鹿和山羊，初步建立了梅花鹿、马鹿和山羊分选精液的低剂量授精技术体系。

这些案例展示了FACS技术在基因表达研究中的多样化应用，包括酶的定向进化、特定细胞亚群的分离和富集、新医学靶基因的高通量筛选，以及性别控制技术中的精子分离。通过这些应用，FACS技术为基因表达研究提供了强大的工具，促进了生物医学研究的发展。