分子互作之核酸与蛋白互作

蛋白与核酸的相互作用广泛存在于生命活动的调节中。基因的复制、转录、翻译、修饰等过程都离不开核酸和蛋白的互作。科沿有道提供RNA pull down+质谱、双荧光素酶、染色质免疫共沉淀、凝胶迁移或电泳迁移率检测（EMSA）、酵母单杂交、DNA pull down等技术来检测DNA/RNA与蛋白的相互作用。

 

一、RNA pull down

蛋白质与RNA 的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等。科沿有道现提供RNA pull down 检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测，能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且科沿有道配套自己的质谱平台，能显著提升检测效果。

 

1.1实验流程：

（1）RNA探针标记；

（2）胞浆蛋白提取；

（3）与磁珠结合、洗脱；

（4）WB检测或者质谱鉴定。

 

1.2实验例图：

图. pull down下来的蛋白银染图

根据胶上条带的差异情况和实验目的，选择质谱或者WB鉴定pull down下来的蛋白

图. SDS-PAGE电泳后质谱鉴定

 

二、DNA Pull down：

DNA pull down是用于分析蛋白质与DNA互作的一种分析技术。该实验首先需要针对待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针。同时，制备细胞核提取物；将探针和核提取物共同孵育，DNA结合蛋白就会和靶向序列特异性结合。然后，通过亲和素磁珠纯化蛋白质DNA复合物。最后针对获得的蛋白，使用WB验证或者质谱方式鉴定蛋白质类型。

 

2.1实验流程：

（1）采用基因组DNA做模板，经PCR扩增特定片段；

（2）将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功；

（3）使用PCR法或末端标记法标记探针；

（4）标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；

（5）细胞核物质分离提取与探针孵育；

（6）探针蛋白复合物洗脱与纯化；

（7）WB蛋白验证或者质谱鉴定。

2.2技术应用：

Examples of the liquid chemiluminescent DNA pull-down assay.

 

三、RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）：

RIP（RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。科沿有道可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。

 

3.1实验流程：

（1）载体构建及转染；

（2）细胞裂解液获取；

（3）磁珠的准备；

（4）RNA结合蛋白免疫沉淀；

（5）RNA纯化及鉴定（测序）。

 

3.2实验例图：

使用目的蛋白寻找验证RNA（蛋白/RNA互作）

图. AP-1蛋白与RNA的相互作用RIP

 

四、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）：

ChIP染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

 

4.1实验流程：

（1）细胞固定；

（2）染色质断裂；

（3）染色质免疫沉淀；

（4）交联反应的逆转；

（5）DNA的纯化；

（6）DNA的鉴定。

 

4.2实验例图：

A.Rapid increase of histone acetylation in silent genes caused by HDAC inhibitor treatment.

B.The ChIP-Seq signals for the DIPA gene (active) and FOSL1 gene (silent) were displayed.

 

五、凝胶迁移或电泳迁移率检测（EMSA）：

凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA 序列相互结合的技术，可用于定性和定量分析。目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用，是转录因子研究的经典方法。科沿有道帮助您检测DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

 

5.1实验流程：

（1）实验设计；

（2）合成探针；

（3）生物素标记探针及标记效率检测；

（4）EMSA电泳凝胶配置；

（5）EMSA反应；

（6）电泳检测；

（7）显色反应。

 

5.2实验例图：

The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.

 

六、酵母单杂交（Y1H）：

将提取的样品RNA 逆转录成单链cDNA,经长距离聚合酶链反应扩增得到双链cDNA，再经CHROMA SPIN TE-400 柱子纯化后与酵母表达载体pGADT7-Rec 线性质粒共转至Y1HGold[pBait-AbAi]酵母感受态，经SD/-Leu/AbA 缺陷培养基筛选出与诱饵序列相互作用的猎物蛋白。

 

6.1实验流程：

（1）总RNA提取；

（2）mRNA分离纯化；

（3）cDNA单链的合成融合；

（4）cDNA双链的的合成；

（5）双链cDNA的纯化；

（6）线性化pBait-AbAi质粒转化；

（7）单杂交cDNA文库构建及筛选；

（8）PCR鉴定蓝斑克隆中插入的cDNA片段；

（9）抽提阳性克隆子prey质粒；

（10）测序及验证。

 

6.2实验例图：

图. 酵母单杂原理图

Description of the Y1H screens approach conducted with Zat12 promoter segments as baits.