免疫组化染色

病理染色实验——免疫组化染色

实验介绍

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

实验步骤

（1）切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。

（2）抗原修复：切片放入配置好的足够量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）中，放在高温的电磁炉上修复时间为10-15min，室温放置40min左右冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。

（3）阻断内源性过氧化物酶：3%的过氧化氢滴加于切片组织，室温孵育15min，PBS冲洗3次，每次3min。

（4）血清封闭：滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

（5）加一抗：滴加稀释好的一抗，加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。
（6）加酶标二抗：PBS冲洗切片3次，滴加HRP标记的山羊抗兔/小鼠二抗，室温或37℃孵育20min。

（7）加显色剂：PBS冲洗切片4次，滴加DAB显色液。

（8）复染：Harris苏木素复染，一般30s-1min左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用自来水（或PBS）水洗返蓝。
（9）脱水：将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明。
（10）封片：将中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，镜检拍照。

实验案例